离子色谱/脉冲安培法测定奶粉中低聚果糖含量

摘要：本文建立了测定奶粉中的低聚果糖含量的离子色谱方法。该方法以 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 为色谱柱，氢氧化钠和醋酸钠为流动相梯度洗脱，采用脉冲安培法进行检测。果糖在 0.08 mg/L～35 mg/L 浓度范围内显示了良好的线性关系，加标回收率在 90%左右。采用电化学检测是一种简单快速、高灵敏、抗干扰的分析方法。

关键词：离子色谱法；低聚果糖；奶粉; 脉冲安培检测

1. 引言
低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由 1～3 个果糖基通过 β(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物[1]。低聚果糖是一种天然活性物质，具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能 [2]。作为添加双歧因子（低聚半乳糖，低聚果糖）,低聚果糖常添加于奶粉中以增强产品的营养功能。目前在寡糖类物质的分析方面，主要有三类方法：酶学法、化学法和色谱法。酶学法具有非常灵敏和高特异性等特点，但容易受样品中污染物干扰，并且酶的来源和纯化也有困难。化学法在分析糖类物质时只能测定出总糖和还原糖的含量。色谱法则可将各种低聚糖相互分离和分别定量，常用于糖分析的色谱方法有气相色谱法、液相色谱法、液质联用、毛细管电泳法、离子色谱法等[3]。离子色谱分离结合脉冲安培检测是目前糖分析的理想方法，该方法基于糖在碱性淋洗液中离子化后在阴离子交换柱上进行分离[4-6]，方法抗干扰性强，灵敏度高。

2. 实验部分
2.1 仪器与试剂
Metrohm 850 离子色谱仪；858 自动样品处理系统；安培检测器，配有金工作电极和钯参比电极；数据处理系统：MagIC Net 2.3 Professional。氢氧化钠溶液（50–52%，Fluka 72064）；NaAc(优级纯,Sigma 71183)；果糖（98%,分析纯）；马来酸（C4H4O4，分析纯）；硼氢化钠（NaBH4，分析纯）；冰乙酸（CH3COOH，分析纯）；三水乙酸钠（CH3COONa•3H2O，分析纯）；菊粉(低聚果糖含量 96.3%)；低聚果糖试剂盒：蔗糖混合酶（其中蔗糖酶 100U，β -淀粉酶 500 U，支链淀粉酶 100U，麦芽糖酶 1000U）；果聚糖混合酶（外切 1000U，内切 100U）：其中果糖和蔗糖的含量均不超过 0.005%， Megazyme；超纯水（电阻率>18 MΩ·cm，25 °C)。 2.2 试剂配制马来酸钠缓冲溶液（100mmol/L，pH6.5）：称取 1.16g 马来酸于 150mL 烧杯中，加入约 70mL 水溶解，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值 6.5，用水稀释至 100mL。4℃保存，可放置 3 个月蔗糖混合酶溶液（蔗糖酶约 4.5U/mL，β-淀粉酶约 23U/mL，支链淀粉酶约 4.5U/mL，麦芽糖酶约 45U/mL）：将 1 瓶蔗糖复合酶溶解在 22mL 马来酸钠缓冲溶液，分装到 2mL 的聚丙烯的试管中，-20℃保存，可放置 6 个月。氢氧化钠溶液（50mmol/L）：称取 2g 氢氧化钠（至 0.1g），溶于水溶解并用水稀释至 1000mL。硼氢化钠溶液（10mg/mL）：称取 50mg 硼氢化钠于聚丙烯试管中，用 50mmol/L 氢氧化钠溶液溶解，zui终浓度为 10mg/mL，用时现配。乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取 0.6mL 冰乙酸，用水稀释至 50mL。乙酸钠溶液（0.2mol/L）：称取 1.36 三水乙酸钠（至 0.01g），溶于水溶解并用水稀释至 50mL。乙酸钠缓冲溶液：吸取 14mL 乙酸溶液和 11mL 乙酸钠溶液混合，并用水稀释至 50mL。果聚糖混合酶溶液（约外切 45.5U/mL，内切 4.55U/mL）：将 1 瓶果聚糖混合酶溶解在 22mL 乙酸钠缓冲溶液，分装到 2mL 的聚丙烯的试管中，-20℃保存，可放置 6 个月。果糖标准溶液：称取果糖 0.0110g，，用超纯水定容到 50ml，制得果糖 215.6 mg/L 标准溶液，逐级稀释得到浓度为 0.086，0.172，0.431，0.862，1.725，3.450，8.624，17.248，34.496mg/L 的标准工作溶液。 2.3 样品制备将奶粉混匀，准确称取奶粉 S1-2 约 1.2g，奶粉 S1-3 约 1.0g（至 0.1mg，至少含有低聚果糖 20mg）于 150mL 烧杯中，加入 80℃热水约 50mL，置于 80℃恒温水浴振荡器中，振摇 15min 后，取出，冷却至室温，转移至 100mL 容量瓶中，用水分三次冲洗烧杯，用水定容，摇匀，溶液经滤纸过滤，取 500μL 上清液于 25mL 容量瓶中，加入 1000μL 蔗糖酶溶液，摇匀，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振摇 10s，酶解 60min 后，加入 500μL 硼氢化钠溶液，摇匀，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振摇 10s，反应 30min 后，取出，冷却至室温，加入 1.25mL 0.2mol/L 乙酸溶液，摇匀，静置 10min，加入 250μL 果聚糖酶，摇匀，置于 40℃ 水浴中，每隔 10min 振摇 10s，反应 30min 后，取出，冷却至室温。用水定容至刻度线，样液依次通过 0.45μm 水相滤膜和 RP 柱，弃去前面 6mL，收集后面洗脱液待测。准确称取菊粉 1.6g，溶解并定容在 100ml 容量瓶中，回收率实验时在称好的样品中添加菊粉(1ml 相当于果糖 2.505mg/L)，其它步骤相同，与样品一起处理。 2.4 色谱条件色谱柱：Hamilton RCX-30 - 250/4.6；淋洗液采用高压梯度模式：NaOH 90 mmol/L (0-22min)；NaOH 150 mmol/L+ 500 mmol/L NaAc(22-35min)；NaOH 90 mmol/L (35-60min)。流速：1.0 mL/min；柱温：32℃；进样量：20 μL；检测方式：脉冲安培法检测，检测温度： 35℃。检测波形参数：E1=0.05 V；E2=0.55 V； E3=-0.1 V；t1=300 ms； t2=50 ms；t3=200 ms。

3. 结果与讨论
3.1 色谱条件选择
离子色谱法测定糖类物质是通过将其在碱性淋洗液中离子化后在阴离子交换柱上进行分离，本文选用 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 色谱柱，对于果糖与其余单双糖的分离效果良好。大部分添加低聚果糖的食品中会含有一些单双糖，同时前处理过程中也会产生葡萄糖等单糖，而这些单双糖也会影响到低聚果糖的分离，因此在试验中必须使用梯度洗脱程序，既能达到较好的分离，也能使分析时间缩短。

3.2 标准曲线与检出限
在 2.4 色谱条件下，将不同浓度果糖标准溶液依次进样分析，以被测糖的质量浓度 Q( mg /L) 对相应的峰面积 A 作标准曲线，分别得到线性方程为 A=1.12752+1.94065，线性相关系数为 0.9994，线性范围可达到 4 个数量级，按照 3 倍信噪比计算检出限为 0.0694mg/L。

3.3 样品分析
本文对两种奶粉样品进行了分析，实际色谱分析的是样品处理后的果糖含量，结果计算时果糖与低聚果糖的转换系数为 1.23，得到检测值分别为 3.25%和 5.73%，与标示值接近，表明此方法可行性好。图 1 是奶粉样品溶液色谱图。图 1 奶粉 S1-2 色谱图选用奶粉样品 S1-2，精密称定，并分别加入高、中、低 3 种浓度的菊粉溶液，充分混匀，按照本实验方法进行前处理后测定，平行测定 6 份，平均回收率均在 90%以上，结果见表 1. 表 1 奶粉 S1-2 回收率与精密度测定结果样品名称 样品含量(mg/L) 加标量(mg/L) 平均回收率（%）， n=6 RSD% S1-2 6.36 2.505 96.49 0.34 5.010 93.01 2.12 7.515 91.71 0.89

4. 结论
本文采用离子色谱分离，脉冲安培检测法测定了奶粉中的低聚果糖，采用优化的梯度洗脱程序，有效分离了葡萄糖、果糖和蔗糖。该方法灵敏度高，线性范围宽，有较好的精密度和准确度，可用于奶粉等食品样品中低聚果糖含量的日常分析。

参考文献
 [1] 陈亚非，罗琪珊，葛亚中。低聚果糖调节机体免疫功能作用的进展[J]。现代食品科技，2003，21（4）： 83-87
[2]杨正梅，卜友泉，何瑞国。低聚果糖的生物学效应及其安全性研究进展[J].生命科学研究，2004，8（4）： 122-126
[3]刘修鹏。离子色谱法测定食品中低聚果糖和饮用水中 F -、Cl-、NO3 -和 SO4 2-的研究[D].硕士学位论文，2007.
[4]王美菡，李敏，郭健，刘修鹏。离子交换色谱法测定保健食品中低聚果糖含量[J]。中国卫生检验杂志， 2007，17（6）：961-963
[5]张绩觅，刘玉峰，唐华澄，李东。离子色谱法测定食品中低聚果糖的含量[J].。食品研究与开发，2012， 33(1):135-138
[6]AOAC Official Method 997.08. Fructans in food products ion exchangechromatographic method[EB]